SPPIN - Saints-Pères Paris Institute for the Neurosciences - CNRS UMR 8003
Université Paris Cité
F-75006 Paris
France

Dr. Ahmed Hamraoui

Assistant Professor
Team 3 - Motor Neurons & NeuroMuscular Junctions

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Nouvel article « Les neurones sont élastiques… » ( article HAL, annonce INSP )

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Patent

  • Nerve repair implant: International application
    A Hamraoui, O Sénépart, C Legay : Patent # : PCT A B2023/000262, 2023
  • Propriétés mécaniques des neurones
  • Physique de la croissance axonale
  • Surfaces autonettoyantes
  • Innovations contre les Infections Périprothétiques
  • Transferts vers l’industrie

La régénérescence du système nerveux central et périphérique, suite à une pathologie ou un traumatisme, est un enjeu sociétal majeur dans un contexte de vieillissement de la population. Cette plasticité pilotée par la croissance et la différenciation des cellules en neurones par exemple dépend de bons nombres de paramètres. La corrélation entre ces mécanismes de réparation et la réponse élastique de l’environnement et des cellules elles-mêmes est souvent évoquée mais reste encore à ce jour difficilement quantifiable. Néanmoins, des chercheurs de l’INSP en collaboration avec le LCMCP et SPPIN ont franchi une étape cruciale vers cet objectif en quantifiant, à l’échelle micrométrique, les inhomogénéités élastiques au cœur même du neurone.

Cell mapping according to the fitted frequency fB(GHz). Blue dots : 11.9 < fB <12.9. Red dots : 9.0 < fB < 11.9. Greendots : fB <9.0

Boostez et orienter la régénération nerveuse : Un regard sur la croissance axonale

Pour élaborer les circuits neuronaux, les axones doivent interpréter divers signaux de guidage, générés à différentes étapes et localisations, afin de se diriger vers leurs cibles. Comprendre ces interactions ouvrirait la voie à l’utilisation de biomatériaux novateurs pour restaurer la fonction en cas de lésions. Ce projet se concentre spécifiquement sur la réparation des axones des motoneurones suite à des traumatismes graves. Une caractéristique distinctive du système nerveux périphérique réside dans la longueur de ses axones, rendant leur régénération lente et inefficace. Ainsi, il est crucial de développer des mécanismes de régénération accélérée, ce qui exige une compréhension approfondie des interactions neuronales avec leur environnement.

Bien qu’il existe des solutions novatrices pour stimuler la réparation nerveuse, les mécanismes exacts de la régénération neuronale restent mal compris. De plus, mon projet explore l’utilisation du champ électrique pour accélérer la régénération, une approche prometteuse mais largement sous-exploitée.

Stratégies expérimentales pour stimuler la croissance axonale

Nous avons étudié la stimulation, sans NGF, de la croissance axonale sur des surfaces qui combinent une nano-structuration physique à laquelle sont associés des gradients locaux de l’énergie d’adhésion [PMID : 19419846 ; PMID : 20149439].

Système étudié et préparation de la surface : exemple

Les substrats utilisés sont des lamelles de verre dont la surface est préalablement traitée par chimisorption d’amino-silane : C8H22N2O3Si (EDA pour Ethyl-Di-Amine, voir figure 1a). Pour assurer une surface propre, celles-ci subissent un dégraissage dans deux bains successifs de chloroforme, agités par ultrasons pendant 20 minutes. Ensuite, le substrat est immergé dans un mélange d’eau oxygénée et d’acide sulfurique dans un rapport 3/7 v :v, suivi d’un rinçage à l’eau distillée et d’un séchage sous flux d’azote.

La silanisation est réalisée en plongeant la surface propre dans une solution composée de méthanol (94%), d’acide acétique (1mM), d’eau (4%) et d’EDA (2%), pour une durée déterminée selon les expériences. Après cette étape, les surfaces sont rincées au méthanol et séchées sous un flux d’azote. Elles peuvent ensuite être stockées et aseptisées dans le méthanol. La figure 1b illustre le schéma de la molécule EDA polycondensée sur la surface de verre hydroxylée, tandis que la figure 1c présente une image de la topographie de la surface verre-EDA obtenue par AFM en mode tapping.

Figure 1: (a) schéma de la molécule N[3-(trimethyl-silyl)propyl]ethylen-diamine : C8H22N2O3Si (EDA pour Ethyl-Di-Amine) (b) schéma de la molécule EDA poly condensée sur du verre (c) image AFM en mode tapping d’une lamelle recouverte d’EDA avec un temps d’incubation de 12h.

Exemples de Résultats et discussion :

La figure 2 représente trois photographies de réseaux de neurites formées après 5 jours de culture de PC12 sur des surfaces verre-EDA et sans NGF (fig. 2a, la figure 2c montre des PC12 cultivées sur PLL en présence de NGF dans le milieu de culture (pour le protocole en détail voir les références [PMID : 19419846 ; PMID : 20149439] ). Il est évident que la présence des gradients locaux dans l’énergie d’adhésion ont un effet significatif sur la genèse des neurites et probablement sur leur vitesse de croissance.

Figure 2 : images obtenues au bout de cinq jours de culture : (a) Réseaux de neurites formés par des PC12cultivées sans NGF sur verre-EDA. (b) PC12 sur PLL. (c) PC12 sur PLL avec NGF. L’agrandissement est de 20x. A ce stade, on compte environ 108 cellules par boites de
15 cm de diamètre (5,6 105 cm−2 environ).

En utilisant une méthode simple de fixation des cellules avec du glutaraldéhyde à 2% (v/v) dans le milieu de culture, nous avons réussi à visualiser des cônes de croissance à l’aide du microscope à force atomique (AFM). La Figure 3 illustre un cône de croissance d’un neurone PC12, offrant une représentation des variations de hauteur. Cette image fournit des informations précieuses : elle indique initialement une hauteur d’environ 4 μm pour une neurite à son extrémité, avec une largeur d’environ 1 μm. Il est important de noter que les filopodes ne sont pas exclusivement situés à l’extrémité du cône, mais sont répartis tout autour de celui-ci de manière relativement uniforme dans toutes les directions. La figure 4 illustre la topographie d’un filopode, dont les dimensions mesurées sont d’environ 200 nm de largeur et 40 nm de hauteur. Cela suggère que le filopode peut réagir aux gradients locaux dans l’énergie d’adhésion.

Figure 3 : Image AFM d’un cône de croissance d’un neurone en culture sur une surface verre- EDA. L’image est réalisée sur une cellule fixée par du glutaraldehyde
2%v : v dans le milieu de culture.
Figure 4 : L’image de gauche présente la topographie d’un filopode capturée par AFM, tandis que l’image de droite est un agrandissement sur 1μm de la surface de verre-EDA. On constate que la taille d’un domaine d’EDA est similaire au diamètre du filopode.

Un exemple supplémentaire illustrant la confirmation de notre hypothèse sur l’importance du gradient dans l’énergie d’adhésion dans la neuritogenèse est présenté dans la figure 5. Cette figure met en évidence des cellules PC12 cultivées sur trois surfaces distinctes, chacune modifiée par des molécules terminées par un groupe −CH3. Ces surfaces ont été caractérisées à l’aide de spectroscopie de génération de fréquence-somme (SFG). La SFG permet de distinguer la classe 1 des classes 2 et 3, ces dernières se distinguant par des distributions différentes de la composante
non-dispersive (γp) de l’énergie de surface, comme le montre la figure 6. Les figures 5 et 6 mettent
également en évidence une corrélation significative entre l’ordre surfacique, la distribution des
composantes dispersives γd et non-dispersives γp des énergies de surface des substrats, d’une
part, et l’adhésion et la différenciation des cellules PC12, d’autre part. Les trois classes de surfaces sont les suivantes :

  • Classe 1 : OTS (Octadécyltrichlorosilane)
  • Classe 2 : ODMS (Octadécyldiméthylméthoxysilane)
  • Classe 3 : HTMS (n-Hexyltriméthoxysilane)
Figure 5 : Cellules PC12 sans NGF 48h après ensemencement sur les 3 classes de substrats −CH3/−OH. La barre d’échelle vaut 200μm
Figure 6 : Distribution des composantes dispersives γd et non-dispersives γp des énergies des surfaces des substrats de verre modifiés par des alkylsiloxanes à terminaison −CH3

Innovations Contre la Poussière: Des Panneaux Solaires plus Performants sur Terre et dans l’Espace

L’accumulation de poussière sur les panneaux solaires constitue un véritable problème, comme le montre l’exemple du Sahara où le sable s’amasse en grande quantité. Cependant, diverses solutions sont en cours d’étude, notamment le nettoyage électrostatique, qui consiste à charger les particules de poussière pour les éliminer par effet électrostatique. Ce sujet est également applicable au domaine spatial, où la poussière et les particules peuvent affecter les performances des panneaux solaires sur les engins spatiaux. L’objectif est de caractériser les propriétés superficielles et la structure du matériau en utilisant différentes techniques disponibles au laboratoire, parmi lesquelles les mesures d’angle de contact sont particulièrement importantes.

Je participe à ce projet en tant que responsable des programmes de prématuration avec la SATT-Lutech et du programme TOUBKAL2024 en partenariat avec le Maroc.

Vers des Implants plus Sûrs: Innovations contre les Infections Articulaires Périprothétiques

Dans le cadre du programme de prématuration avec la SATT-Lutech et de la collaboration avec la Fédération Hospitalo Universitaire PROTHEE, je suis impliqué dans l’élaboration d’un dispositif implantable aux propriétés dynamiques de sa surface. L’augmentation de l’espérance de vie et de la qualité de vie, ainsi que les exigences fonctionnelles élevées de la population âgée, expliquent la hausse des procédures impliquant l’implantation de biomatériaux.

Entre 2005 et 2030, la demande d’arthroplasties totales de la hanche devrait augmenter de 174 %, atteignant 572 000 procédures, et celle des arthroplasties du genou de 673 %, atteignant 3,48 millions de procédures aux États-Unis. Comme 1 à 2 % des arthroplasties entraînent une infection, l’incidence des infections articulaires périprothétiques (IAP) augmentera avec le temps. Bien que ces infections soient rares, elles sont difficiles à prévenir, diagnostiquer et guérir, nécessitant souvent des opérations multiples, des hospitalisations prolongées, des réadmissions fréquentes et l’utilisation prolongée d’antibiotiques et d’analgésiques. L’IAP est donc l’une des complications chirurgicales les plus complexes et graves, tant pour les patients que pour les chirurgiens et le système de santé. Elle est aussi une cause majeure de procès en raison des séquelles pour les patients. Le coût annuel des réopérations pour infection dans les hôpitaux américains est passé de 320 millions de dollars à 566 millions de dollars entre 2001 et 2009.

L’arthroplastie, reflétant le vieillissement de la population, est une procédure de plus en plus courante. En France, plus de 200 000 arthroplasties sont réalisées chaque année, entraînant plus de 3 000 infections articulaires prothétiques (IAP) ; le taux d’incidence (1,5 %) augmente avec l’accroissement des comorbidités des patients. Ces infections, difficiles à prévenir, diagnostiquer et guérir, nécessitent souvent des opérations multiples, des hospitalisations prolongées et l’utilisation prolongée d’antibiotiques, entraînant un impact physique et psychosocial significatif pour les patients et des coûts élevés pour le système de santé. Malgré les avancées du Centre de Référence des Infections Ostéo-Articulaires Complexes (CRIOAC), les IAP restent peu explorées par la recherche, y compris dans les domaines de la pathologie osseuse et des biomatériaux.

La prévention des IAP repose sur deux méthodes innovantes développées par des équipes de recherche : un biomatériau à surface modifiée inhibant l’adhésion bactérienne et un dispositif implantable pour nettoyer la surface des biomatériaux/prothèses. Le diagnostic microbiologique des IAP utilise de nouvelles techniques, notamment la métagénomique, en exploitant l’équipement existant pour l’identification virale à l’hôpital Saint-Louis.

Des études in-vitro montrent que l’application de champs électriques sur des surfaces empêche l’adhésion des bactéries, telles qu’Escherichia coli (voir figure 1).

Ce projet vise à appliquer cette observation en combinant des champs électriques localisés et des surfaces chimiquement modifiées pour prévenir les infections bactériennes sur les prothèses.

Cette approche offre la flexibilité d’ajuster l’amplitude (tension) et la durée de la stimulation en fonction du pathogène ciblé.

Le dispositif de test utilisé permet une activation à distance des micro-champs électriques, permettant une utilisation embarquée et non invasive via une stimulation transcutanée.

La validation de principe a été réalisée avec succès en utilisant E. coli. Une déclaration d’invention a été déposée à Sorbonne Université et le projet a été transféré à la SATT-Lutech, qui a validé la déclaration d’invention et alloué des fonds pour financer la première phase de prématuration avant d’envisager un dépôt de brevet.